1. はじめに

　私は化学 （蛋白質化学）出身であるが、virusの生態に興味を持ち、動物virusの研究を 始めた。ある種のvirusは感染した細胞にがんを起こし得ることを知り、 virusによるがん化のメカニズムを明らかにすることがその後の私の研究の一 貫したテーマとなった。1961年に渡米し、本格的にこの問題と取り組んだが、 virus-細胞の系の生物学的解析から仕事は始まった。virusの遺伝学的研究か らvirus genomeの本態が次第に明らかになり、それと共に分子生物学的研究が 導入された。がん化を起こす遺伝子がvirusに含まれていることが発見され、 しかもその遺伝子は本来宿主細胞に由来するものであるが、virusに取り込ま れた結果がんを起こす能力を獲得することを推定することができた。この「が ん遺伝子」の概念はその後、更に一般化されて、細胞遺伝子の種々の変異がが んの生成の主な原因であるという今日の考えの基礎を作った。これらの virusのがん遺伝子が作る蛋白質についても tyrosine kinaseを始め多くの新 しい産物が同定され、その解析はtransformationにかかわる細胞蛋白質の研究 に大きく貢献することができた。また我々が発見した　SH2, SH3ドメインが多 くのがんウイルスの作る蛋白質の中に存在し、このような構造が蛋白質の相互 作用を通して情報伝達に重要な役割を果たしていることが見出された。細胞蛋 白質の変異とそれに伴う情報伝達の変化はがん細胞の一つの中心問題として研 究が続けられている。

3. 遺伝学的研究
　
　 RSVの遺伝学的研究は急速には進 まなかったが、いくつかの重要な知見をもたらした。既に述べた増殖の defective なB-RSVに更に変異を起こした結果、後述するreverse transcriptase の遺伝子を欠くmutantを見出すことができた(3)。これによってpolymeraseが増殖に必須であることを遺伝学的 に証明することができた。Transformation に関わる変異株としてはまず最初 に温度依存性変異株（temperature sensitive [ts] mutant）があげられる。 Ts mutant に感染した細胞は、温度を上げるだけで、virus産生に変化を及ぼ すことなく、transformation の形質だけが失われる。大切な点は、この細胞 形質の温度による変化はvirusのmutationによるものであるから、細胞の変化 は感染したRSVによって起こされたものであることが、この実験から明確に示 されたことである(4)。つまり virusがtransformation を起こす遺伝子を持っていることが直接証明されたこ とになった。 ２番目のmutant はdeletion mutantとよばれるもので、RSVの増 殖の過程で高頻度でRAVに近似したhelper typeのvirusのpopuplationが増加す ることを見出した。これはtransforming 遺伝子がspontaneousに失われる結果 だと解釈された(5)。この研 究も先に述べたdefective virusの場合と同じようにtransforming geneがなく てもvirusが増殖し得ることは明らかであるが、deleteされる部位が transformation に必要であるということが新しく示された。このmutantは後 述するsrc遺伝子のidentificationに重要な役割を果たした。

(3) Hanafusa, H., and Hanafusa, T.; Noninfectious RSV deficient in DNA polymerase. Virology 43, 313-316 (1971)

(4)Kawai, S., and Hanafusa, H.; The effects of reciprocal changes in temperature on the transformed state of cells infected with a Rous sarcoma virus mutant. Virology 46, 470-479 (1971)

(5)Kawai, S., and Hanafusa, H.; Genetic recombination with avian tumor virus. Virology 49, 37-44 (1972)

6. DNA technologyの導入ーがん遺伝子の概念

　 1970年代の後半にはDNA technology が利用でき るようになって、virus 分子の解析は急速にすすんだ。詳細はここでは述べな いが、先ず、RSV cDNA は同一のRTaseで二重鎖の DNA に複製される。RSV が 二重鎖DNAの構造をとった時に、その両端に同一の約330塩基からなる sequenceが重複して作られる。この構造はLTR (Large terminal repeat)と呼 ばれ、DNA の複製などに必須の構造である。このLTRを両端に持つ二重鎖DNA は、細胞のDNA に全体がそのままの形で取り込まれる。細胞のDNA への取り込 みは細胞DNAの特定の位置に限られない。Virus RNAはDNAが細胞DNAに取り込ま れて初めてこのLTR からのtranscription が開始され、RSVのRNA が再生産さ れる。さて単独のがん遺伝子に対するDNA の作成について最もよく知られてい るものはsrcに対するcDNAであった。Stehelin, Varmus, Bishop & Vogt(Nature[1976]260,170)はsrc-specific cDNAの作成に次のような方法を用 いた。RSVのtotal RNAの二重鎖DNAと前述したRSVのdeletion mutant (src部分 が特異的に欠けたもの)のRNA をhybridizeさせた。これによってsrc cDNAだけ がsingle strandとして分けることが出来た。このcDNAがsrcに特異的に反応す ることは、RSV とRAVのRNAとのhybridizationの有無によって確認された。重 要なことは、このsrc cDNAは正常なニワトリの細胞DNAと反応させると意外に もhybridizationが起こることが示されたことであった。このことは正常細胞 の中にsrcと近似したDNA配列が存在することを強く示唆するものであった。つ まりRSV のsrc遺伝子は正常細胞中に存在し、稀にこの遺伝子とretrovirus と の間に組み換え(recombination)が起こって、その結果RSVのようなvirusが生 成した可能性が考えられる。細菌ウイルスの世界ではtransduction という現 象が知られているが、retrovirusによるRSVの生成、そしてRSVによる新しい細 胞のtransformationはtransductionと非常に近いメカニズムによると考えられ る。

　上記の結 果はウイルスの遺伝子が細胞のDNA に由来するという全く新しい概念を提供し たが、我々はsrcが細胞由来の遺伝子であることを遺伝学的に証明することを 試みた。既に述べたRSVのdeletion mutantの中にはsrc遺伝子が全部失われて いない場合が見出されていた(7)。もしも細胞のDNAの中に src遺伝子に近似したものが存在するならば、このようなpartial mutantと reombinationを起こし、deletion によって失われた遺伝子が修復され完全な 形のsrcを持つvirus が生まれるかも知れないと考えられた。このような想定 のもとに、約70％のsrcが失われたvirusをニワトリに注射した。予想通りこの mutantsは注射部位には何の変化も見られなかったが、約２ヶ月後からトリの 種々の部位に腫瘍が見出され、どの腫瘍からもtransformationを起こし得る virus が回収された。得られたvirus のRNA の分析からも、回収されたvirus はRSVと殆ど変わらないことが分り、更に得られたvirus RNAの3'末端は細胞の srcであることが証明することができた(8)。この実験はStehelinたちの 分子生物学的手法を使った実験と同様に、正常細胞の中にvirus のsrcに非常 に近い遺伝子が存在し、それがvirus のがん遺伝子となったことを示したもの であった。

(7)Kawai, S., and Hanafusa, H.; Recombination between a temperature-sensitive mutant and a deletion mutant of Rous sarcoma virus. J. Virol. 19, 389-397 (1976)

(8)Hanafusa, H., Halpern, C., Buchhagen, D. L., and Kawai, S.; Recovery of avian sarcoma virus from tumors induced by transformation-defective mutants. J. Exp. Med. 146, 1735-1747 (1977)

13. SH2, SH3による酵素活性の調節

　 このようにSH2, SH3は細胞生物学にとって重要な要素となっ たが、もう一つの重要な機能は単一蛋白質の立体構造に関与し、しばしばその 蛋白質の活性を支配することである。ここでもその最も良い例はSrc蛋白質で ある。第11章に述べたようにv-Srcはc-Src　とそのC末端の構造が異なる。こ の中で特に注目されるのはc-Srcの527番目のTyrであってこのTyrはv-Srcには 存在しない。このC末端のTyrが燐酸化されて、Src蛋白質のN末端に存在する SH2と結合すれば分子は半ば環状構造をとることになり、それによってSrcの後 半C末端部分に存在する酵素の活性中心が妨害されるのではないかと予想され た。このことはKuriyan たちのX線を用いた結晶解析によって見事に実証され た。更に意外なことに、SH2とkinaseのドメインを連結するlinker 部分に、同 じSrc分子のSH3と結合し得るアミノ酸結合が見出されたことであった。SH2と Tyr527の相互作用によってSH3が適当な位置に移動し、それに伴ってlinkerの 位置が変動することが示された。しかしこれらのSH2, SH3によるc-Srcの酵素 活性の制御についてはまだ全貌は明らかになっていないといえる。この外、 Crkにおいても（c Crkは二つのSH3を持つ）SH3 がAblというkinaseの prolineを多く含んだ構造と親和性があり、その結果AblはCrkと結合する。 Ablはkinaseであるから２つのSH3の間にあるTyrが燐酸化され、その燐酸化さ れた構造がCrk自身のSH2と会合することが分かった(19)。このようにSH2, SH3と蛋白 質の構造との相互作用によってその蛋白質の内部構造、それに伴う生化学的活 性の変化が広汎に認められている。

　最後に、 SH2とSH3は高等動物の中ではこのように広汎な分布を持つが、下等生物では SH2を持つ蛋白質（主にSTATなど）が僅かに粘菌(Dictoslelium)、シロイヌナ ズナなどに見られているが、Tyrosin kinaseの存在は知られていない。それに 比してSH3は酵母に比較的多種類見出されている。 Srcは海綿に発見されてい るので、 SH2-kinaseの系は多細胞動物への分化と共に生まれたように見え る。このような発生学的な問題を見直すことも大変 興味が深い。

(19) Feller, S. M., Knudsen, B., Hanafusa, H.; c-Abl kinase regulates the protein binding activity of c-Crk. EMBO J. 13, 2341-2351 (1994)

Reviews

1. Hanafusa, H.; Nature of the defectiveness of Rous sarcoma virus. Natl. Cancer Inst. Monograph. 17, 543-556 (1964).

2. Hanafusa, H.; Avian RNA tumor viruses. In Cancer - A Comprehensive Treatise, Vol. 2. F. F. Becker, ed. New York: Plenum Publishing Corp., pp. 49-90 (1977).

3. Hanafusa, H.; Cell transformation by RNAtumor viruses. In Comprehensive Virology, Vol. 10.
H. Fraenkel-Conrat and R. R. Wagner, eds. New York: Plenam Publishing, p. 401-483 (1977).

4. Hanafusa, H.; Cellular origin of transforming genes of RNA tumor viruses. In Harvey Lecture Series 75. New York: Academic Press, 255-275 (1981).

5. Jove, R., and Hanafusa, H.; Cell transformation by the viral src oncogene. Ann. Rev. Cell Biol. 3, 31-56 (1987).